如果說(shuō)Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法將生物學(xué)劃分為前PCR時(shí)代和后PCR時(shí)代，那么數(shù)字PCR的產(chǎn)生將分子檢測(cè)劃分為了定性檢測(cè)時(shí)代和定量檢測(cè)時(shí)代。但是數(shù)字PCR檢測(cè)≠定量檢測(cè)，數(shù)字PCR只是一個(gè)工具，只有這個(gè)工具具備了定量檢測(cè)的條件才能實(shí)現(xiàn)真正的定量檢測(cè)，否則都是“偽定量”。
一、什么是定量檢測(cè)
1.定性和定量檢測(cè)
通俗的理解，定性檢測(cè)是測(cè)定待測(cè)物的“質(zhì)”，如物理、化學(xué)、生物等，鑒定其是與非，有和無(wú)；定量檢測(cè)是測(cè)定待測(cè)物的“量”，如質(zhì)量、長(zhǎng)度、物質(zhì)的量等等。
2.核酸檢測(cè)方法中的定量檢測(cè)方法
是否為定量檢測(cè)不是以檢測(cè)結(jié)果是否是數(shù)值為依據(jù)，對(duì)于核酸檢測(cè)，OD260/280計(jì)算核酸濃度和熒光定量PCR都是定性檢測(cè)方法；只有數(shù)字PCR屬于定量檢測(cè)方法。
3.數(shù)字PCR的偽定量
數(shù)字PCR是一個(gè)定量工具，但是如果數(shù)字PCR方法沒(méi)有經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證，獲得的定量結(jié)果也只是個(gè)偽定量結(jié)果，或者結(jié)果不準(zhǔn)確，或者偏差較大。目前在數(shù)字PCR推廣和使用中最大的問(wèn)題就是：數(shù)字PCR廠家只強(qiáng)調(diào)儀器的硬件參數(shù)（分割單元數(shù)、多通道和開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)）；用戶將熒光定量PCR方法在不做方法優(yōu)化和驗(yàn)證的情況下直接應(yīng)用于數(shù)字PCR平臺(tái)，最終的結(jié)果是數(shù)字PCR成為一個(gè)定量不準(zhǔn)的定性檢測(cè)工具。
4.計(jì)量溯源
要實(shí)現(xiàn)定量，通常需將測(cè)量的結(jié)果與國(guó)際單位制SI單位聯(lián)系起來(lái)。國(guó)際單位制的七個(gè)基本單位：長(zhǎng)度（米）、質(zhì)量（千克）、時(shí)間（秒）、電流（安培）、熱力學(xué)溫度（開(kāi)爾文）、物質(zhì)的量（摩爾）和發(fā)光強(qiáng)度（坎德拉）。
“具有計(jì)數(shù)特征的量（包括特定核酸序列的拷貝）的單位為1。單位為1的單元本質(zhì)上是任何單元系統(tǒng)的一個(gè)元素。單位為1的量可視為可溯源至SI 單位摩爾。因此，可以通過(guò)適當(dāng)?shù)?、?jīng)過(guò)驗(yàn)證的測(cè)量程序來(lái)得出對(duì)SI的計(jì)量溯源性?！?ISO 20395：2019
5.不確定度
追求真值和追求真理一樣困難！定量檢測(cè)的最大困難是測(cè)準(zhǔn)，因?yàn)檎嬷涤肋h(yuǎn)是求之而不得的，也是人類孜孜不倦努力的目標(biāo)。我們當(dāng)下能做到的是獲得真值所在的區(qū)間，并不斷縮小這個(gè)區(qū)間，這個(gè)區(qū)間就是不確定度，它包含了測(cè)量中所有產(chǎn)生的誤差（不確定分量）。
1.數(shù)字PCR的原理
數(shù)字PCR是將核酸模板分布在等體積的多個(gè)分割單元中，使得一些分割單元包含模板而其它分割單元不包含模板，然后對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并檢測(cè)特定的PCR產(chǎn)物，通過(guò)陽(yáng)性率和泊松分布計(jì)算獲得模板中靶序列拷貝數(shù)濃度。數(shù)字PCR的核心原理就是有限稀釋、終點(diǎn)PCR和泊松分布！
2.數(shù)字PCR的分類
按照單元分割的方式數(shù)字PCR分為液滴式數(shù)字PCR、芯片式數(shù)字PCR和微滴芯片式數(shù)字PCR：
2.1液滴式數(shù)字PCR：通過(guò)油包水生成技術(shù)，生成幾萬(wàn)個(gè)微滴，以伯樂(lè)和新羿生物為代表：
2.2芯片式數(shù)字PCR：使用物理分割的方法，將反應(yīng)液分布到幾萬(wàn)個(gè)微孔中，以賽默飛、凱杰和羅氏為代表：
2.3微滴芯片式數(shù)字PCR：分割方式仍然是生成油包水的微滴，但是將微滴形成單層平鋪到芯片上，以STILLA和思納福為代表：
3.泊松分布
很多人對(duì)數(shù)字PCR定量結(jié)果的質(zhì)疑往往來(lái)源于泊松分布導(dǎo)致的概率，由于以往的核酸檢測(cè)都是定性的，人們已經(jīng)習(xí)慣了陽(yáng)性或者陰性的“確定性”結(jié)果，而不習(xí)慣于存在概率和不確定度的“不確定性”結(jié)果。但是事實(shí)的情況是越能計(jì)算出概率和不確定區(qū)間的結(jié)果越準(zhǔn)確，只給出陰陽(yáng)性的結(jié)果越不準(zhǔn)確。
1.精密度Precision
精密度可分為方法的重復(fù)性（repeatability），中間精密度（intermediate precision）和再現(xiàn)性（reproducibility）。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證時(shí)，應(yīng)確定方法的重復(fù)性和中間精度。可以使用單因素方差分析（ANOVA），計(jì)算重復(fù)性。
2.線性Linearity
通過(guò)對(duì)預(yù)期核酸量值與觀察到的核酸量值進(jìn)行回歸分析，以斜率和相關(guān)系數(shù)R來(lái)表征該范圍內(nèi)的線性度。
觀察值與期望值的期望斜率為1.0，截距為（0,0）。建議斜率在0.95至1.05之間。相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)大于0.99。
3.正確度Trueness
測(cè)量正確度是該方法產(chǎn)生的無(wú)限個(gè)結(jié)果（即現(xiàn)實(shí)中的大量結(jié)果）的平均數(shù)與接受參考值間的一致程度。優(yōu)先使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)獲取合適的參考值。
4.穩(wěn)健性Robustness
在穩(wěn)健性測(cè)試中，應(yīng)研究相關(guān)方法參數(shù)中的小偏差對(duì)方法性能和測(cè)量結(jié)果的影響。可能影響方法結(jié)果的相關(guān)參數(shù)，如引物和探針的濃度、PCR試劑的成分、PCR儀和退火溫度。
5.特異性specificity
應(yīng)評(píng)估分析對(duì)預(yù)期目標(biāo)的特異性以及與典型生物樣品中可能存在的同源序列的潛在交叉反應(yīng)性。
6.最低檢測(cè)限limit of detection，LOD
可被檢出的最低濃度。LOD在不同標(biāo)準(zhǔn)中有不同的計(jì)算方式，如：目視評(píng)價(jià)法，空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法、標(biāo)準(zhǔn)方程法和信噪比法。對(duì)于數(shù)字PCR的LOD評(píng)估我個(gè)人比較傾向于使用空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法評(píng)估LOD。
空白標(biāo)準(zhǔn)偏差法：既通過(guò)分析大量的樣品空白或加入最低可接受濃度的樣品空白來(lái)確定LOD。獨(dú)立測(cè)試的次數(shù)應(yīng)不少于10次，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算方法見(jiàn)下表：
7.最低定量限limit of quantitation，LOQ
樣品中的分析物可被定量檢測(cè)的最低濃度。通常建議空白值加上10倍重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，也可以3倍的LOD或高于方法確認(rèn)中使用最低加標(biāo)量的50%作為L(zhǎng)OQ。
我從2012年就開(kāi)始接觸數(shù)字PCR，后來(lái)因?yàn)橐恢睆氖潞怂針?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究，需要不斷的開(kāi)發(fā)數(shù)字PCR的定量方法，目前已經(jīng)使用過(guò)的數(shù)字PCR儀大概有10種。
數(shù)字PCR本應(yīng)定位為一個(gè)高靈敏度和準(zhǔn)確度的定量工具，各廠家應(yīng)聚焦于如何提高儀器的精密度和準(zhǔn)確度，篩選最匹配的反應(yīng)體系，開(kāi)放平臺(tái)扶持專業(yè)的方法開(kāi)發(fā)者。但是目前的一種不良傾向是大家都在拼硬件性能（微滴數(shù)更多，熒光通道更多），過(guò)度宣傳自己平臺(tái)的開(kāi)放性和通用性，回避普通用戶自己建立定量方法的難度。硬生生把一個(gè)定量工具變成了更靈敏的定性或偽定量工具。數(shù)字PCR是時(shí)候回歸真定量了！
2023-8-21 |
